مهار ژن هومانين جهت بررسي اثرات آن در اثر بخشي داروي Etoposide در رده سلولي سرطان معده

Effects of Silencing of Humanin on Cell Fate and Tumor Cell Responses to Etoposide in AGS Cell Line

سابقه و هدف: هومانين يك پپتيد 24 آمينواسيدي مي‌باشد كه به عنوان فاكتور ايفاكننده‌ي نقش اتوفاژي در نظر گرفته مي‌شود. نقش بديهي آن در مهار آپوپتوز در سلول‌ها مشخص شده است، اما اهميت آن در اتوفاژي در حال بررسي است. در اين مطالعه به بررسي نقش پروتئين هومانين در القاء اتوفاژي و اثر دهي داروي شيمي درماني اتوپوزايد پرداخته شد. مواد و روش‌ها: در اين مطالعه تجربي، جهت سنتز و كلون كردن اين ژن از وكتور pcDNA3.1 استفاده گرديد. با روش الكتروپوريشن وارد رده سلولي AGS شد. ميزان بيان به وسيله‌ي روش‌هاي SDS-PAGEوReal-time PCR با استفاده از پرايمرهاي اختصاصي در رده‌ي سلولي AGS ارزيابي شد. جهت مهار اين ژن از مولكول‌هاي siRNA اختصاصي استفاده گرديد. جهت وارد كردن siRNA به رده سلولي AGS نو تركيب از ليپوفكتامين استفاده شد و اثرات مهار هومانين بر كارآيي عوامل شيمي درماني با استفاده از آزمون‌هاي Real-time PCR وAssay MTT مورد بررسي قرار گرفت. يافته‌ها: با توجه به نتايج داده‌هاي اين مطالعه، دوز 100 نانو مول از siRNA حدود 40 درصد، باعث افزايش مرگ و مير سلول‌هاي سرطاني شد (05/0p<). استنتاج: اين مطالعه، مطالعه اي اوليه در مورد نقش ژن هومانين در القاي autophagy در سلول‌هاي سرطاني بوده است و به طور دقيق مكانيسم آن در القاء autophagy مورد بررسي قرار گرفت. در اين مطالعه مشاهده شد، مهار HN3 مي‌تواند اثر عوامل شيمي درماني در سلول‌هاي سرطاني را افزايش دهد.

Background and purpose: Humanin is a 24-aa peptide that is considered as one of the probable players of autophagy. Its inevitable role in the inhibition of apoptosis in cells is revealed, but its probable importance in autophagy is under evaluation. This study evaluated the role of humanin protein in induction of autophagy and efficacy of chemotherapy drug etoposide. Materials and methods: HN3 gene was synthesized and cloned in pcDNA3.1 vector and electroporated in AGS cell line. Expression analysis in AGS cell line was done by SDS-PAGE and Real-time PCR using specific primers. HN3 gene inhibition was done using specific siRNA molecules. siRNAs transfection to the recombinant AGS cell line was done using Lipofectamine. The effects of the humanin inhibition on efficacy of chemotherapy agents was studied using Real-time PCR and MTT assay. Results: Our data showed that dose of 100 nm of siRNA caused about 40% increase in the mortality of cancer cells. Conclusion: To the best of our knowledge the current research was the first on the role of humanin gene in induction of autophagy in stressful cancer cells that evaluated its exact mechanism in autophagy induction. In addition, HN3 inhibition could increase the efficacy of chemotherapy agents in cancer cells.